BEKA-VAX®: desempeño en campo frente a Renibacterium salmoninarum

Renibacterium salmoninarum es el agente causal de la enfermedad bacteriana del riñón (conocida como BKD por su sigla en inglés), la cual provoca mortalidad en peces, tanto en su estado natural como en salmónidos de cultivo. Esta enfermedad se ha convertido en un desafío para la industria acuícola, dado que impacta en las etapas de producción, tanto en agua dulce como durante la fase de engorda en agua de mar.

Este artículo profundiza en la vacuna BEKA-VAX®, una herramienta desarrollada por Veterquimica para combatir este patógeno, y que cuenta con una capacidad protectora que ha sido demostrada mediante estudios a escala de laboratorio y pruebas de eficacia en campo, supervisadas por el Servicio Agrícola y Ganadero (SAG).

Renibacterium salmoninarum, agente causal de la enfermedad bacteriana del riñón (BKD, por su sigla en inglés), es una bacteria que generalmente se presenta en forma de diplobacilos y es de crecimiento lento y fastidioso, siendo este uno de los principales problemas del método de cultivo y un inconveniente para los programas de control de la salud (Benediktsdóttir, Helgason, & Gudmundsdóttir, 1991). Su tiempo de incubación suele variar entre 18 a 21 días hasta 6 a 9 semanas a 12–15°C en medio definido (Austin, 1985) (Daly & Stevenson, 1993).

BKD es una patología que causa mortalidad en los peces, tanto en su estado natural como en salmónidos de cultivo, afectando las etapas productivas en agua dulce y engorda en agua de mar, con infecciones lentas y progresivas, especialmente en aguas frías (Fyer & Sanders, 1981) (Alcorn, Murray, Pascho, & Varney, 2005). Típicamente, R. salmoninarum, al inicio de la enfermedad no presenta síntomas externos bien definidos en los peces, los que sí se manifiestan en forma muy visible en las etapas avanzadas de la enfermedad con branquias pálidas, hemorragia en áreas cercanas a las aletas, decoloración de la piel y abdomen distendido (Fyer & Sanders, 1981) (Bruno, 1986) (Hirvelä-Koski, Pohjanvirta, Koski, & Sukura, 2006), e incluso exoftalmia severa bilateral, hemorragia sub opercular, y abultamientos y úlceras en casos agudos. Esto ocurre en forma más prevalente cuando los peces permanecen en agua dulce y a baja temperatura.

En cuanto a síntomas internos, la enfermedad se presenta mediante lesiones nodulares focales o multifocales en el riñón, bazo y/o hígado, líquido en la cavidad abdominal, hemorragia en el abdomen o vísceras y una capa membranosa en los órganos internos (Bruno, 1986). Una de las preocupaciones más importantes para los productores de peces, es que esta enfermedad se transmite en forma horizontal y vertical. Esta última, en particular, es un punto de permanente monitoreo en poblaciones de peces destinados a reproducción.

La prevención de esta enfermedad a través de vacunas ha sido objeto de controversia debido a los resultados variables que se han obtenido. En general, las vacunas basadas en patógenos bacterianos inactivados han demostrado ser muy eficaces en peces (Sommerset, Krossøy, Biering, & Frost, 2005). Sin embargo, los tratamientos y enfoques convencionales de vacunas no son efectivos contra R. salmoninarum, ya que no está clara la relación entre la habilidad de producir anticuerpos y la protección contra el patógeno (Alcorn, Murray, Pascho, & Varney, 2005).

Para un eficaz control de esta enfermedad, Veterquimica trabajó por varios años en la investigación y
desarrollo de antígenos capaces de desarrollar una inmunidad protectora contra esta enfermedad. Se trata
de la vacuna contra R. salmoninarum, BEKA-VAX®, que fue elaborada con bacterias locales que contemplan
propiedades inmunogénicas específicas del patógeno.

Su capacidad protectora ha sido demostrada tanto en estudios a escala de laboratorio, como también en pruebas de eficacia en campo supervisadas por el Servicio Agrícola y Ganadero (SAG) en la región de Magallanes, donde existe obligatoriedad de vacunación contra el patógeno causante de BKD (RESA SERNAPESCA N° 6246, 19 diciembre 2017) una medida que forma parte del programa sanitario general de vigilancia y control para la región de Magallanes y Antártica chilena.

Mortalidad en la industria

Durante varios años, el BKD pasó inadvertido en la salmonicultura chilena, sobre todo durante las etapas de agua dulce. Sin embargo, en la actualidad, su prevalencia ha ido en aumento, principalmente en Magallanes, donde se registra una prevalencia y mortalidad considerablemente más altas que en otras zonas de cultivo. Según un informe de mortalidad del año 2023, el 27 % de las pérdidas de peces se atribuyen a causas infecciosas. Mientras que al analizar la distribución de las pérdidas debidas al BKD, se observa que un 28,5% han afectado a la especie de salmón coho, un 6,0% al Salmo salar y un 4,4% a la trucha.

BEKA-VAX^®, una solución para BKD en Chile

BEKA-VAX® es una vacuna inactivada inyectable que ingresó al mercado nacional en enero del 2021. Se trata de un producto autólogo, generado a partir de cepas nacionales de Renibacterium salmoninarum, y está registrado para ser usado en todas las especies de cultivo tradicional en Chile.

Esta vacuna ha pasado por numerosas pruebas de eficacia y seguridad, tanto en condiciones controladas durante su fase de desarrollo, como también en la etapa de campo, en la cual se ha aplicado el producto durante más de 10 meses en peces sembrados en agua de mar, acumulando más de 2.400 UTAs post vacunación.

De acuerdo a los antecedentes recogidos en campo, la vacuna BEKA-VAX® ha demostrado ser muy segura, tanto por sus niveles de adherencia como por no provocar melanosis. De hecho, no se han observado mayores efectos de los generados históricamente por las vacunas múltiples, por lo que ahora incluso se considera la aplicación en forma conjunta. Estos resultados dan cuenta de las evaluaciones realizadas en nuestro laboratorio, como también en estudios externos y se condicen con información obtenida en las pruebas realizadas durante el desarrollo de la vacuna respecto a su seguridad.

En relación a las respuestas serológicas que se han observado en distintas especies y grupos que han sido vacunados con BEKA-VAX®, se ha evidenciado hasta ahora que existe una correcta inducción y montaje de respuesta inmune específica frente a Renibacterium salmoninarum. Además, se han registrado niveles elevados de anticuerpos en las pruebas serológicas realizadas antes de la liberación de los peces al mar.

Estos niveles tienden a disminuir de manera natural con el tiempo, para luego observarse un incremento nuevamente en la producción de anticuerpos cuando los peces se encuentran con el patógeno de manera natural.

Aplicación de la vacuna

Respecto a la aplicación de la vacuna BEKA-VAX® en campo, existen distintos procesos y forma de aplicación. Se ha empleado bajo aplicación simple y única, bajo doble aplicación en dos mesas de vacunación y bajo el esquema de una aplicación con doble sonda.

Todas estas alternativas se utilizan de acuerdo al esquema productivo de cada compañía y en combinación con distintos productos inmunológicos, sin presentar aumento en los efectos secundarios, sino más bien, se observan los mismos efectos registrados por la aplicación simple de las vacunas que se han empleado en la industria hasta ahora.

Resultados inmunológicos y protectores contra R. salmoninarum

a) Medición de marcadores moleculares

Estos se realizan mediante la medición de la “expresión relativa de ARN mensajero de moléculas asociadas a la respuesta inmunológica”.

Con el fin de determinar la respuesta inmune celular, se tomaron muestras de peces después de la vacunación en dos momentos distintos para evaluar tanto su respuesta temprana como tardía (a los 3 y 7 días, respectivamente). Para ello, se extrajo ARN de muestras de cabeza de riñón y del bazo de los peces en estudio. Con esto, se evaluó la expresión relativa de los ARNm de citoquinas NKEF e INF-γ, así como la población celular de linfocitos T CD8. Estos últimos se encuentran asociados a la respuesta inmune citotóxica que es requerida para proteger a los individuos de una infección intracelular, el mecanismo utilizado por R. salmoninarum.

En la Figura 1A, se observa la expresión relativa del factor de aumento de las células Natural Killer, el cual es secretado por los macrófagos como respuesta a una estimulación intracelular. En este caso, se puede ver una sobrerregulación de la expresión de este factor en los peces vacunados con BEKA-VAX®, tanto en los estados tempranos como en los tardíos, a diferencia de la vacuna Control (+), en donde se observa una disminución de la expresión relativa de este factor.

La citoquina INF-γ es expresada por las células linfocitarias para comunicar la existencia de una infección intracelular, con lo cual se activan los macrófagos para que eliminen los agentes intracelulares que tienen fagocitados. En la Figura 1B, se observa que todos los peces vacunados presentan una sobrerregulación de INF-γ. Para el caso de BEKA-VAX® se tiene que, tanto en la respuesta temprana como en la tardía, existe un aumento en la expresión de este factor con respecto al T0, a diferencia del Control (+), en donde sólo en la respuesta tardía se ve este resultado, probablemente debido a la naturaleza de esta vacuna. De todas maneras y a pesar de que todas estas diferencias no son estadísticamente significativas, se observa una tendencia biológica.

Finalmente, los resultados de los análisis de las poblaciones CD-8 demuestran una inducción de la expresión de los ARN mensajeros de los peces vacunados con BEKA-VAX®, tanto en periodos tempranos postvacunación, como en periodos tardíos, lo que indica que el sistema inmune celular de estos peces vacunados fue estimulado.

CD-8 se estudia porque es la población de células encargadas directamente de eliminar patógenos intracelulares como Renibacterium salmoninarum. Por lo tanto, si una vacuna logra estimular esta porción de células, sugiere que está haciendo una presentación de antígenos cruzada, tanto por vía extracelular como intracelular, lo que ayudará en la futura defensa del organismo contra el agente patogénico.

b) Respuesta serológica, anticuerpos específicos contra Renibacterium salmoninarum

El análisis de los títulos serológicos anti-R. salmoninarum se realizó mediante prueba de ELISA, para esto se utilizaron sueros de peces inmunizados de los diferentes grupos a distintos tiempos de muestreo (T0, pre-traslado a mar y post-traslado). La placa ELISA fue activada con un péptido específico, diseñado por bioinformática, que corresponde a una fracción de la proteína P57 de Renibacterium salmoninarum, lo cual le otorga especificidad a la prueba y los sueros en análisis, lo que además garantiza el seguimiento de la respuesta serológica de los peces hacia el futuro.

Los títulos serológicos de ambos grupos vacunados resultaron ser mayores respecto del tiempo 0 a 900 UTA post vacunación, que fue el muestreo previo a traslado a mar, y este punto correspondió al máximo de respuesta serológica de los peces en estudio (Ver Figura 2).

Previo a traslado a mar, la diferencia en los títulos serológicos entre los grupos de BEKA-VAX® y la vacuna Control (+), no difieren de forma estadísticamente significativa entre sí, pero es posible observar una mejor homogeneidad en la secreción de anticuerpos (títulos serológicos) contra R. salmoninarum en el grupo vacunado con BEKA-VAX®, respecto de los peces vacunados con el Control (+).

Adicionalmente, este mismo fenómeno se ve en la medida que pasa el tiempo en mar, por lo tanto, se puede presumir que existe una memoria inmunológica contra el patógeno en los peces inmunizados, siendo los títulos serológicos de los peces vacunados con BEKA-VAX®, siempre mayores y más homogéneos que los peces vacunados con el Control (+), estas diferencias son estadísticamente significativas (Kruskal-Wallis: 62,21; p value < 0,0001).

Es interesante mencionar que en la Figura 2 se aprecia una disminución en el título serológico de los peces a las 1.100 UTAS (aproximadamente 45 días post traslado a mar). Sin embargo, en los siguientes muestreos, se observa un aumento en el título serológico, lo cual coincide con observaciones del centro de cultivo en que se registró una mayor signología contra la enfermedad (incremento en la mortalidad semanal por R.salmoninarum).

Se destaca que el grupo que experimentó un aumento significativo en el título serológico, fue el de los peces vacunados con BEKA-VAX®, lo que permitiría reafirmar que los peces vacunados con esta formulación adquirirán memoria inmunológica.

c) Análisis de morbilidad y mortalidad

La presencia del patógeno o la enfermedad se reduce en forma significativa en poblaciones vacunadas con BEKA-VAX®, siendo detectada la presencia del patógeno hasta 40 semanas post transferencia a agua de mar, pero con peces sin hallazgos de signos clínicos de la enfermedad (sin daños en riñón). Lo que se ha obtenido en diferentes grupos de peces vacunados en 2021.

En cuanto a mortalidades por BKD, la diferencia a favor de peces vacunados es una significativa reducción de la mortalidad de un 20%. Aunque esta diferencia, en el periodo comprendido entre las semanas 25 y 39 del ensayo, no es estadísticamente significativa (Kruskal-Wallis: 62,21; p value = 0,1185), sí existe una tendencia biológica, incluso en este caso, donde existió un brote agudo de la enfermedad en el campo.

Por otro lado, al hacer un análisis de área bajo la curva de los datos mostrados en la Figura 3, se obtiene que la razón entre este parámetro del Control (+) y los grupos vacunados con BEKA-VAX® es de 1,20, lo que se traduce en una protección un 20% más efectiva contra R. salmoninarum al utilizar la vacuna desarrollada por Veterquimica.

En el caso de las jaulas sin tratamiento con antibióticos, las mortalidades semanales tienen una magnitud mucho menor, y una diferencia más clara entre los peces inmunizados con BEKA-VAX® y los vacunados con el Control (+), tal como se observa en la Figura 4.

Estas diferencias son estadísticamente significativas, considerando las 48 semanas del ensayo (Kruskal- Wallis: 62,21; p value = 0,0221). Además, al realizar un análisis de las áreas bajo la curva de los datos de porcentaje de mortalidad semanal en estas jaulas, se obtiene una razón entre el Control (+) y BEKA-VAX® de 2,32, lo que se traduce en una protección 132% más efectiva al utilizar la vacuna de Veterquimica, en comparación con el Control (+), al inmunizar a los salmónidos contra la enfermedad bacteriana del riñón.

Conclusión

En relación a los análisis de la respuesta inmune de los peces en estudio, se realizó un análisis de marcadores moleculares celulares y una cinética de respuesta humoral específica contra el patógeno. Ambos ensayos mostraron que la vacuna BEKA-VAX® es capaz de estimular el sistema inmune al activar rutas celulares (aumento de CD8, NKEF e INF-γ), además permite aumentar el título de anticuerpos específicos contra Renibacterium salmoninarum en comparación al grupo control.

Respecto a la mortalidad de los peces sin tratamiento de antibiótico, se destaca que el grupo vacunado con BEKA-VAX® presenta mortalidades menores estadísticamente significativas respecto al control positivo a la semana 48, lo que se relaciona con una protección mayor contra la enfermedad bacteriana del riñón.

Todos los resultados de las pruebas de eficacia indican que la vacuna BEKA-VAX® de Veterquimica, es eficaz para ayudar en la prevención de la enfermedad bacteriana del riñón, demostrando una inmunidad de más de 1.800 UTA en condiciones de campo en peces no sometidos a tratamientos con antibióticos.

Autores

Tomás Cancino

Investigador

Gerencia Investigación y Desarrollo, Veterquimica

Loreto Tapia

Jefe Laboratorio Puerto Montt

Gerencia Investigación y Desarrollo, Veterquimica

Iván Valdés

Jefe de Biotecnología Nutribiótica

Gerencia Investigación y Desarrollo, Veterquimica

Luis Montoya

Subgerente de Producto y Servicios Aqua

Gerencia Aqua, Veterquimica

Referencias

Alcorn, S., Murray, A., Pascho, R., & Varney, J. (2005). A cohabitation challenge to compare the efficacies of vaccines for bacterial kidney disease (BKD) in chinook salmon Oncorhynchus tshawytscha. Diseases of Aquatic Organisms, 63:151-160, doi:10.3354/dao063151.

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Sommerset, I., Krossøy, B., Biering, E., & Frost, P. (2005). Vaccines for fish in aquaculture. Expert review of vaccines, 4(1), 89–101. https://doi.org/10.1586/14760584.4.1.89.