Rickemune-Vax®: protección a largo plazo contra el Síndrome Rickettsial del Salmón

Hoy en día el principal problema que enfrentan los cultivos de salmónidos en nuestro país, están relacionados con la fase de crecimiento y engorda en agua de mar. Esto se debe a la presencia de un patógeno intracelular facultativo, de características epidemiológicas altamente invasivo, y cada día más prevalente. Este patógeno que presenta un aumento sostenido en  la frecuencia de aparición de brotes a nivel de los lotes cultivados y es altamente potente desde la perspectiva infecciosa se denomina Septicemia o Síndrome Rickettsial del Salmón (SRS), el cual además de sus características propias, reviste impacto en las poblaciones cultivadas  al asociarse a otras patologías bacterianas que, si bien no son propias del agua de mar, se arrastran desde la fase de agua dulce, como la Enfermedad Bacteriana del Riñón (BKD por sus siglas en inglés) causada por Renibacterium salmoninarum.  

La bacteria Rickettsial ya es conocida en Chile y la estrategia de control más recurrida por parte de los productores ha sido la terapia curativa mediante el uso de antibióticos. No obstante, esta estrategia ha mostrado problemas, tanto técnicos, debido a la resistencia creciente en el tiempo por parte de los aislados presentes, como de alarma y alerta pública frente a uso indiscriminado y poco riguroso de estas herramientas. Esta presión ha motivado a que los laboratorios veterinarios centren sus esfuerzos en desarrollar terapias vaccinales que permitan evitar el uso de antibióticos en estos cuadros y además implementar terapias preventivas que eviten las pérdidas asociadas a un brote provocadas por el patógeno.

Es sabido que la vacunación ha permitido a la industria del salmón controlar numerosas enfermedades. Sin embargo, las infecciones con P. salmonis persisten, posiblemente porque, al ser un patógeno intracelular facultativo, requiere formulaciones de vacuna con capacidad dual para inducir tanto una respuesta humoral como una respuesta celular. 

Rickemune-Vax^®, por la pureza de su antígeno y la utilización en su formulación de un adyuvante de última generación, tiene la capacidad de inducir en forma equilibrada una respuesta inmune, humoral y celular en los peces vacunados. 

Además, estimula el sistema inmune innato y adquirido en poblaciones de Salmo salar, esto se demostró mediante la cuantificación relativa de marcadores moleculares asociados al sistema inmune de los peces y por serología. Adicionalmente, mediante ensayos de eficacia de la vacuna Rickemune-Vax^® frente al patógeno, se determinó un RPS>70%, tanto en desafío realizados a 600 UTA como a 2100 UTA.

Características y relevancia del SRS en cultivo de salmónidos

La enfermedad infecciosa, considerada como la principal causa de mortalidades en la salmonicultura nacional es la Septicemia o Síndrome Rickettsial del Salmón (SRS), provocando anualmente grandes pérdidas a la industria chilena. Entre sus características se incluyen: se presenta frecuentemente luego de algunas semanas que el pez haya sido introducido al agua de mar; los peces infectados se observan letárgicos, orillados, y presentan movimientos verticales o circulares; se evidencia oscurecimiento de piel, exoftalmia y distensión abdominal; en etapas avanzadas de la enfermedad se observa frecuentemente aumento de la mortalidad acumulada desde un 2 a un 40%; uno de los primeros signos clínicos evidenciados son pequeñas lesiones blancas a nivel de piel que luego nodulan para posteriormente ulcerarse. También se puede observar a nivel de musculatura la presencia de cavitaciones con contenido seroso de tipo abscedativo. Las lesiones observadas en piel implican varios grados de abrasión y posterior necrosis de epidermis, dermis y muscular subyacente (Sandoval. 2012). Sin embargo, en brotes agudos la mortalidad puede presentarse sin mayores signos de enfermedad. 

A nivel de cavidad abdominal, una de las lesiones patognomónicas de la enfermedad, es la presencia de hígado pálido amarillo con nodulaciones subcapsulares con halos hemorrágicos en su periferia. También se observan hemorragias petequiales en grasa peripilórica, grasa visceral y vejiga natatoria, palidez de órganos parenquimatosos, hepatomegalia, renomegalia, esplenomegalia, intestino y estómago hemorrágico, además de hemorragia sobre la superficie cerebral. La patología más marcada es la necrosis y edema con una respuesta granulomatosa, siendo encontrada en tejido hematopoyético de riñón, bazo y hepatocitos en hígado (Sandoval, 2012).

Están reconocidas como vías de entrada al pez de P. salmonis, la piel, las branquias, y por vía oral, siendo esta última la menos preferida por la bacteria para infectar los peces (Larenas et al., 2003). Además, se ha reportado que su sobrevida en agua de mar le permitiría infectar peces por vía horizontal sin requerir un hospedero intermedio (Lannan y Fryer, 1994). Una vez que la bacteria supera las barreras físicas del pez, esta infecta, sobrevive, replica y se propaga en los macrófagos de salmónidos (Rojas et al., 2009), alterando la función de eliminación de bacterias por parte de estos, al impedir la fusión del fagosoma al lisosoma (McCarthy at al., 2008). Finalmente, provoca la muerte de los macrófagos al inducir su apoptosis, (Rojas et al., 2010). Tacchi et al. (2011), observó que en los estadíos tempranos de infección de salmones por P. salmonis, ocurría una disminución de transcritos de genes involucrados en la respuesta inmune adaptativa. Por lo tanto, no es de extrañar que SRS sea el causante de más del 60% de las mortalidades inducidas por enfermedades infecciosas en centros de engorda en agua de mar. 

La ausencia de tratamientos efectivos contra SRS ha acentuado la necesidad de desarrollar estrategias que prevengan la enfermedad. Una alternativa es la vacunación, ya que este método ha permitido a la industria del salmón controlar numerosas enfermedades, desde hace ya bastante tiempo, a nivel de los países tradicionalmente productores de salmón y truchas en cautiverio. En Chile, el uso de vacunas para la acuicultura, se remonta a comienzos de la década de los 80’, y en la actualidad se dispone de varias formulaciones, ya sean bacterinas, virinas o recombinantes, para infecciones usualmente presentes en los centros de cultivo. Muchas de estas vacunas, por acuerdos de la misma industria, deben ser administradas a los peces de manera obligatoria.

En el caso de infecciones controladas con P. salmonis, Smith et al., (1997) lograron proteger peces pre-smolts inyectando una bacterina vía intraperitoneal. Sin embargo, una formulación semejante, pero concentrada no consiguió la misma protección. Por esta razón se han utilizado diversas maneras de obtener antígenos efectivos contra P. salmonis ya sea mediante extracción por calor, recombinación de ellos o prototipos basados en el ácido nucleico bacteriano. 

Estos y otros ensayos de vacunación han mostrado que los salmónidos desarrollan una respuesta inmune adaptativa a este patógeno. Esto se ha concluido a partir de numerosos ensayos de vacunación-desafío y ha sido confirmado por el aislamiento de anticuerpos específicos.  

Desde los trabajos de Watts et al. a inicios del 2000, se sabe que los peces teleósteos poseen sistema inmune innato y adquirido. Además, la respuesta innata mediada por las células presentadoras, define si se evoca una respuesta predominantemente mediada por células o predominantemente mediada por anticuerpos. En el caso de P. salmonis, un patógeno intracelular facultativo, es sabido que se requeriría de formulaciones vaccinales, con capacidad dual de inducir tanto una respuesta humoral como una respuesta celular.  Esto resulta ser un factor clave en la efectividad y la duración del efecto protector de las vacunas que actualmente están disponibles en el mercado y explicarían las fallas en la eficacia protectora de larga duración. 

Piscirickettsiosis: situación actual

En la actualidad, a la luz de los últimos antecedentes, la autoridad salmonera nacional ha establecido un control exhaustivo sobre las áreas destinadas a la producción de salmónidos en nuestras regiones australes, a esto se suma la implementación de un programa nacional de vigilancia activa en el cual están fuertemente involucrados los productores, y las asociaciones gremiales de productores y criadores.

Rickemune-Vax^® 

El concepto o premisa que dio origen a Rickemune-Vax^®, vacuna contra SRS, fue disponer de una formulación vaccinal efectiva, que mejorara la entrada de los antígenos de P. salmonis a las células presentadoras de los salmónidos, lo que permite lograr una mejor activación del sistema inmune innato y adaptativo, desarrollando así una inmunidad protectora contra dicho patógeno intracelular. 

Es un hecho comprobado que para elaborar vacunas altamente eficientes se debe considerar y conocer los factores antigénicos, relacionados con el hospedero del agente infeccioso, como también el serotipo predominante del patógeno en cada sector geográfico afectado, antes de la formulación de la vacuna. Para el desarrollo de Rickemune-Vax^® esto no fue la excepción, se analizaron y caracterizaron más de 40 aislados de sectores representativos del sur de Chile (Figura 1).

Para la caracterización genética de los aislados se utilizaron técnicas de fingerprinting, las cuales determinaron dos grupos genéticos. uno mayoritariamente relacionado a la cepa LF-89 y otro menor vinculado con la cepa EM-90, esto se ratificó mediante secuenciación de los genes 16S e ITS de los aislados, situación que coincide con la literatura técnica específica. (Figura 2).

Sin embargo, al hacer un análisis antigénico de los aislados, se determinó mediante estudios de perfiles de proteínas totales, ELISA SRS usando Kit comercial o Western blot (Figura 3), que sólo existía un serogrupo en todos los aislados estudiados. Por esta razón se determinó utilizar una cepa de P. salmonis representativa de la realidad nacional para la vacuna, que además presenta características de patogenicidad que la hacen única. 

La segunda innovación importante de Rickemune-Vax^® fue el medio de cultivo en que se multiplica y crece la bacteria. Aunque los métodos estándar de crecimiento de P. salmonis se basan en el cultivo de la bacteria en líneas celulares susceptibles como CHSE-214, la cepa escogida para Rickemune-Vax^® fue cultivada en placas de Agar, mejorando sustancialmente la pureza del antígeno, sin la presencia de restos celulares, así como también permite aumentar la concentración bacteriana en las formulaciones, sin generar factores inductores de inmunosupresión. Además, este método, mantiene las características de la bacteria en términos de morfología espacial (conformación) y patogenicidad.

A esto se suma, que en la preparación de las formulaciones de este efectivo producto vaccinal, se utiliza un adyuvante de última generación, diseñado para generar una respuesta equilibrada de anticuerpos y células. 

En los ensayos realizados por el área técnica de I+D de Veterquimica, en peces vacunados con Rickemune-Vax^® se observó un aumento de las poblaciones celulares de linfocitos CD4 y CD8. Además, mediante el empleo de RT-PCR en tiempo real, se detectó un incremento en las citoquinas INF-γ y NKEF (Figura 4).  Se espera que estos marcadores reflejen aumentos en los efectores de la citotoxicidad mediada por células, los cuales fueron identificados como células tipo linfocitiarias citotóxicas (CTLs) y tipo natural killer (NK) (Utke et al., 2007). Adicionalmente, se vieron incrementos en la cantidad de anticuerpos específicos anti P. salmonis a largo plazo (1900 y 2055 UTA, Figura 5). 

Una vez conocidos los efectos en el sistema inmune de los peces, se realizaron ensayos de inmunización y desafío para evaluar la eficacia de la vacuna.  En las pruebas de corto plazo (600 UTA), se obtuvo un porcentaje de sobrevida los peces (RPS) inmunizados con Rickemune-Vax^® por sobre el 70% cuando el 60% de los peces controles había muerto y este RPS se mantuvo sobre un 70% al finalizar el ensayo (Figura 6). 

Sin embargo, el desafío siempre fue generar una vacuna que protegiera del Síndrome Rickettsial del Salmón pasadas las 2000 UTA, para esto se inmunizaron y se desafiaron a los peces pasado este tiempo. Los resultados mostraron que Rickemune-Vax^® es capaz de producir RPS por sobre 70% en peces inmunizados por más de 2100 UTA.

Conclusiones

• Rickemune-Vax^® es un efectivo producto inmunológico diseñado para otorgar protección de largo plazo a los salmónidos en cultivo contra el SRS.

• La vacuna es elaborada a partir de aislados puros de una cepa patógena local, representativa tanto genética como antigénicamente de aislados de P. salmonis obtenidos desde centros positivos a la enfermedad. 

• La bacteria fue multiplicada y cultivada en placas de Agar manteniendo todas las características de morfología y patogenicidad propias de la bacteria. 

• Rickemune-Vax^®, estimula el sistema inmune innato y específico de peces inmunizados, una condición protectora que se mantiene activa y altamente reactiva contra el patógeno, aún pasadas 2100 UTA post vacunación.

Autor

Iván Valdés, Jefe de Biotecnología Nutribiótica